单细胞测序
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单细胞测序

10xG scRNA-seq

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1、技术简介

    10x Genomics RNA-seq 单细胞测序技术是以单个细胞为单位,通过全基因组或转录组扩增,进行高通量测序,获得相应数据并进行信息分析的技术。通过信息发掘、研究可揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态,反映细胞间的异质性,其在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用。

2、信息分析

    1.质控分析
    2.数据统计(Cell Ranger)
    3.细胞过滤(Cell filtering)
    4.样本tSNE分型分析
    5.多样本Cluster占比
    6.差异基因展示
    7.功能富集分析
    8.差异基因TF注释

3. 样本要求

    a.样本类型:
        细胞(植物细胞需制成原生质体)、组织(一般需要鲜样不可冷冻)、血液、冻存的单细胞悬液 需复苏后活性大于80%; 

    b.样品总量:
        细胞悬浮液样本细胞起始量最好50w(指制备成单细胞悬液时最初的量,活性,裂红,镜检), 最低风险尝试量10w细胞; 

    c.细胞大小:
       直径在5-30μm,几乎涵盖各种动物细胞类型(大于30 μm 细胞需制备成细胞核,但可能会丢失更 多信息);
    d. 细胞浓度:
        700~1200 cell/ μl; 


4. 经典案例
   Zheng H, Pomyen Y, et al. Single-cellanalysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma [J].HEPATOLOGY, 2018 Jul;68(1):127-140
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    这篇文献中,研究者通过单细胞转录组及功能分析发现:肝癌细胞中肿瘤干细胞在表型、功能及转录水平上表现出异质性;不同的干细胞亚群具有不同的分子特征,而且不同亚群中特异的基因之间相互独立,并与肝癌的预后相关。该研究结果提示我们,不同的肝肿瘤干细胞转录组影响瘤内异质性及肿瘤的发展。

    通过GemCode技术(10X Genomics)对HuH1, HuH7 和 P1细胞进行单细胞RNA测序,探究整个细胞群体的多样性。结果发现:与特异分子标     记的单个细胞分析数据一致,单个细胞群集于不同的细胞类型;众所周知的肿瘤干细胞表面标志物,例如EpCAM, CD133, CK-19 和ALDH1A1,个体细胞间表达差异很大;同样的,一些已知的与肝癌发生相关的肝细胞癌特异基因,比如AFP, MDK, GPC3, GOLM1,YY1AP1,PLK1, ECT2和NELFE,在每个细胞群落和不同的细胞类型中同样具有异质性。此外,研究者通过数据库分析了肝癌干细胞异质性与肝癌预后间的关系,发现了在HuH1细胞系中有45个基因,HuH7细胞系中有1066个基因异质性与肝癌存活及预后相关。

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