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m6A RNA测序

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1、产品简介

    m6A (N-6 ethyladenosine)存在于mRNA及非编码RNA的修饰,含量非常的丰富,可以影响RNA的剪切,翻译,稳定性。 在1974年,m6A首先由俩个独立的小组在Poly(A)RNA的片段中检测到,但是由于当时技术的限制,关于m6A的研究一直处于停滞状态。当时检测m6A的手段局限于RNA水解方法,这就意味着,这种方法只能检测总体的m6A的含量,而不能检测单个mRNA的m6A的含量,另外,这也很容易受到同mRNA共纯化的其他RNA的污染,另外一个限制就是,在反转录过程中,m6A被当做是A,所以就很难在cDNA序列中检测到。很幸运,由于在技术的突破,在2012年, Rechavi及Jaffrey课题组同时描述了MeRIP-Seq/m6A-seq技术,这是一种在转录组水平上高通量检测m6A的方法。这种方法揭示了 m6A修饰是一种不均匀的分布,值得注意的是,m6A是选择性的分布模式:仅仅只有部分mRNA才会有 m6A,另外m6A定位在终止密码子附近以及3‘UTR中,同时m6A是高度动态性的,随着发育阶段的不同, m6A的水平变化非常的大。这些研究表明, m6A可以影响细胞中mRNA的命运及功能。

    MeRIP-Seq/m6A-seq,该技术通过用m6A特异的抗体将含m6A修饰的mRNA从总mRNA中富集出来,再结合高通量测序技术和结合生物信息学分析,即可全基因组范围内对m6A修饰的状况进行系统研究。

2、产品优势

灵敏度高:每个样本可获得数百万条的序列标签,可发现并研究转录组中稀有的甲基化修饰片段;
检测范围广:覆盖整个转录组范围的所有甲基化区域
分辨率高:能够在实际结合位点100-200bp碱基范围内精确定位
数字化信号:直接对甲基化片段进行定量和测序,不存在传统芯片杂交的荧光模式带来的交叉反应和背景噪音问题

3、信息分析

    1. 对原始数据进行去除接头污染序列及低质量 reads 的处理
    2. 原始数据基本质量控制
    3. 原始数据回帖到参考基因组
    4. m6A-seq数据信号分布情况
    5. 富集位点的进化保守性分析
    6. 富集位点MOTIF分析
    7. 富集位点差异基因筛选
    8. 差异基因的KEGG Pathway富集分析
    9. 差异基因的Gene ontology富集分析

4、送样和周期

a、细胞样本
    数目大于100millin(1x108)。上海周边地区可以送贴壁或悬浮细胞,常温运输。其他地区需要用Trizol处理细胞,-80度冻存,干冰寄样。
b、动物组织
    >3g。组织需要新鲜,无血管无结缔组织等杂质。在冰上将组织样本切成小块,迅速放入RNAlater溶液,-80度冻存,干冰运输。
c、植物组织
    >5g,锡纸包裹,液氮冻存,干冰运输。。
d.RNA样本
    总RNA量:total RNA>300ug,OD 1.6/1.8:1.6-2.3,RIN>7
e、周期
    40个工作日

5、经典案例

    FTO Plays an Oncogenic Role in Acute Myeloid Leukemia as a N 6 -Methyladenosine RNA


    Demethylase. Cancer Cell January 9, 2017,31, 1–15.

    研究者通过整理之前的RNA芯片数据,发现FTO(m6A去甲基化酶)在特定急性髓系白血病中高表达,并且通过质谱检测发现,在含MLL-AF9融合蛋白的白血病中,m6A的整体水平比对照组低。那么,FTO在特定白血病亚型中的高表达,是否是其发挥了癌基因的功能呢?通过构建稳定敲低FTO的细胞系,研究者在细胞实验和动物实验中证明,敲低FTO可以显著抑制肿瘤细胞的增殖以及延长实验小鼠的生存时间。接下来,就是文章的重点和难点——FTO发挥癌基因作用的具体机制是什么?关于机制的探索,这不仅是m6A研究的重点,相信也是每个课题都要面对的问题。幸运的是,FTO做为m6A的去甲基化酶,功能是相对确定的,要寻找FTO的具体作用机制,实际上是寻找FTO靶向的mRNA。研究者通过对过表达FTO和正常样品的m6A-seq测序,发现了一批在过表达FTO后m6A修饰减少的基因,然后结合普通RNA测序,发现这些m6A减少的mRNA在表达量上也发生了变化。研究者从变化倍数以及基因本身的功能着手,最终锁定了两个基因:ASB2和RARA.并认为它们是FTO最主要的靶标,并在western blot实验以及双荧光素酶实验中得到了验证。



 

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